貼心小NOTE

Note1：如果需要減少反應(yīng)過程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對酶標(biāo)板材的非特異吸附，在包被過程中，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據(jù)抗原抗體的親和力大小來進(jìn)行判斷優(yōu)化。一般來說親和力越強(qiáng)，所需的抗原包被濃度越低。

Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。

Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明顯上下平臺期的全曲線，當(dāng)抗原抗體間親和力較強(qiáng)時，梯度濃度可縮小，稀釋的倍數(shù)可在方法學(xué)優(yōu)化過程中縮小至2倍。

Note4：酶聯(lián)抗體效應(yīng)過量，酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體，如果高低兩個稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號傳遞未產(chǎn)生偏差。

對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以初略計算下酶聯(lián)抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當(dāng)酶聯(lián)抗體濃度較小時，酶聯(lián)抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到，曲線有假上平臺。

Note5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應(yīng)控制信號值不要超過3，當(dāng)信號值超過線性范圍時，曲線有假上平臺。

Note6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。

Note7：標(biāo)準(zhǔn)的劑量曲線擬合一般用四參數(shù)擬合，需要有明顯的上下平臺期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之間，EC50（C值）即為抗體相對于抗原的親和力值。